1.         Was sind Zelllinien?

Eine Zelllinie ist ein immortalisiertes Gewebe, das aus Explantaten von Primärgewebe gewonnen wird. Zellkulturen sind für die biomedizinische und molekularbiologische Forschung unverzichtbar, da Zelllinien ein leistungsfähiges Modellsystem in vitro darstellen.

Krebszelllinien, endliche Zelllinien, gesunde, aber immortalisierte Zelllinien und induzierte pluripotente Stammzellen werden häufig anstelle von Primärzellen und Primärkulturen verwendet, da sie kostengünstig und einfach zu pflegen sind und biologisches Material für die Forschung unbegrenzt zur Verfügung steht. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Zellteilungen können Primärzellkulturen nur wenige Tage lang aufrechterhalten werden, bevor sie absterben. Diese Bedingungen schränken die Reproduzierbarkeit von Experimenten ein, da keine identischen Zellen verwendet werden können. Zelllinien hingegen ermöglichen reproduzierbare Ergebnisse, da ähnliche Zellen für die Forschung verwendet werden können. Die Zelllinie muss authentifiziert, frei von Mykoplasmen und anderen Verunreinigungen sein und aus einer zuverlässigen Quelle wie dem CLS oder anderen Biorepositorien stammen.

2.       Welche Arten von Zelllinien gibt es?

2.1.         Menschliche Zelllinien

Menschliche Zelllinien sind unsterbliche Zellen, die in vitro aus primären Explantaten von menschlichem Gewebe oder Körperflüssigkeiten gezüchtet wurden. Seit der Wende zum 20. Jahrhundert nutzen Wissenschaftler Zelllinien, um Erkenntnisse über die Zellbiologie und den Stoffwechsel zu gewinnen. Zelllinien oder unsterbliche Zelllinien sind in der Literatur über Zellkulturen zu einem beliebten Modell geworden, das als gut charakterisierte und optimierte Einheit für die pharmakologische Forschung, biochemische Analysen, die Synthese bioaktiver Substanzen usw. dient. Wissenschaftler bevorzugen Zelllinien gegenüber Primärzellen, da sie kostengünstiger und benutzerfreundlicher sind und mehr Passagen durchlaufen können. Da Zelllinien einfach zu manipulieren und zu vermehren sind, werden sie für zahlreiche Screenings bevorzugt, da sie einen unendlichen Vorrat an Material bieten.

2.2.         Tierische Zelllinien

Tierische Zelllinien sind für die Forschung in den Bereichen Zellbiologie und Biomedizin unverzichtbar: Die Kultivierung tierischer Zellen bietet ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung grundlegender Aspekte der Zellbiologie und des Stoffwechsels. Tierische Zellkulturen wurden als 2D- und 3D-Modell für die Untersuchung von Infektionserregern und Arzneimitteln in einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen eingesetzt. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung einer tierischen Zelllinie für die Forschung ist der geringere Bedarf an Tiermodellen. Da Tiermodelle menschlichen Systemen ähnlicher sind, können Forscher mit Hilfe von Tierzellen eine Vielzahl von Krankheitsverläufen untersuchen und innovative Behandlungen in Tiermodellen evaluieren, bevor sie diese Erkenntnisse auf menschliche Patienten anwenden.

2.3.         Was sind unsterbliche Zelllinien und wie werden sie hergestellt?

Die erste Zelllinie wurde geschaffen, indem man eine Probe menschlicher Krebszellen in ein flüssiges Medium mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren (heute als Zellkulturmedium bekannt) gab und die Zellen sich teilen ließ. Nach einem längeren Zeitraum wurde festgestellt, dass die Zellkultur überleben und sich (durch klonale Expansion) unbegrenzt teilen konnte. Die Zellkultur mutierte jedoch gleichzeitig weiter, so dass verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften entstanden, obwohl sie von derselben Krebsstammzelle abstammten.

Heute gibt es zahlreiche Möglichkeiten zur Herstellung von Zelllinien, darunter:

• Zellisolierung aus einer Krebsprobe (wie im obigen Absatz beschrieben)
• Einführung von viralen Genen, die die Zellzyklusregulation deregulieren
• Hybridomtechnik

Folgend sind bekannte Beispiele für potenziell unsterbliche Zelllinien aufgelistet: 

 Vorteile von immortalisierten Zelllinien

• Standardisierung: Immortalisierte Zelllinien werden von vielen verschiedenen Labors verwendet, was zu einem gut charakterisierten und standardisierten System führt.
• Konsistente und reproduzierbare Ergebnisse: Aufgrund ihrer homogenen und genetisch identischen Beschaffenheit sind die Ergebnisse, die mit immortalisierten Zelllinien erzielt werden, konsistenter und besser reproduzierbar.
• Einfachere Kultur: Immortalisierte Zelllinien wachsen robuster und müssen nicht aus einem lebenden Tier extrahiert werden, was ihre Kultivierung im Vergleich zu Zellen in Primärkulturen erleichtert.
• Hohe Proteinausbeute: Immortalisierte Zellen wachsen schnell und kontinuierlich und ermöglichen die Extraktion großer Mengen von Proteinen für biochemische Untersuchungen.
• Genexpression: Es ist möglich, Zelllinien zu erzeugen, die kontinuierlich ein bestimmtes Gen exprimieren, z. B. eine fluoreszierende Markierung oder eine mutierte Version eines Proteins.

Nachteile von immortalisierten Zelllinien

• Fehlende Normalität: Immortalisierte Zellen teilen sich unbegrenzt und können einzigartige Genmuster exprimieren, die in normalen Zellen nicht vorkommen, was sie für die Untersuchung relativ normaler Zellen ungeeignet macht.
• Charakteristische Veränderungen: Kontinuierliches Wachstum kann im Laufe der Zeit zu Veränderungen der Zelleigenschaften führen, so dass sich die Zellen noch stärker von normalen Zellen unterscheiden.
• Validierung erforderlich: Es ist wichtig, die Eigenschaften der kultivierten Zellen regelmäßig zu überprüfen, um sicherzustellen, dass sie sich im Laufe der Zeit nicht verändert haben, vor allem, wenn die Zellen zu oft passagiert wurden.

Was ist ein Beispiel für eine Zelllinie?

HeLa: Die älteste und bis heute am häufigsten verwendete unsterbliche Zelllinie ist die HeLa Zelllinie. Die Zellen wurden aus einer Probe von Gebärmutterhalskrebs isoliert, der durch eine Infektion mit dem humanen Papillomavirus 18 (HPV-18) verursacht wurde. Eine HeLa-Zellkultur wurde verwendet, um das Polio-Virus zu erhalten, den Polio-Impfstoff zu testen und ihn für die Entwicklung des ersten Polio-Impfstoffs in Massenproduktion herzustellen.

HEK293: In den 1970er Jahren wurde die HEK293 Zelllinie von Alex van der Eb an der Universität Utrecht aus menschlichen embryonalen Nierenzellen gewonnen wurde. Mehrere Kopien der Adenovirus-Gene E1A und E1B verleihen den HEK293-Zellen eine hohe Transfektionseffizienz. Dies macht sie in der Biotechnologie nützlich, insbesondere für die Proteinexpression und Gentherapie, neben anderen Anwendungen. HEK293-Zellen finden breite Anwendung in der industriellen Biotechnologie, wo sie zur Herstellung rekombinanter Proteine und Enzyme eingesetzt werden.

CHO: 1957 etablierte T. T. Puck die CHO-Zelllinie, indem er Zellen aus dem Eierstock eines erwachsenen chinesischen Hamsters isolierte. Diese Zelllinie hat sich seitdem zu einem unverzichtbaren Modell für die Biotechnologie entwickelt. Die Zellen werden in großem Umfang für die Herstellung von rekombinanten Proteinen wie therapeutischen Antikörpern und Impfstoffen verwendet. In der Toxikologie werden CHO-Zellen als Modellorganismen verwendet, um die Auswirkungen von Chemikalien, Medikamenten und anderen Toxinen auf das Zellwachstum und den Stoffwechsel zu untersuchen.  Die Zellen werden für die Bioproduktion von monoklonalen Antikörpern, rekombinanten Proteinen und Impfstoffen verwendet. Mehr als sechzig therapeutische Proteine, die mit CHO-Zellen hergestellt wurden, sind für die Produktion zugelassen. Diese Zelllinie wird seit Jahrzehnten in der Biotechnologie für die industrielle Biotechnologie, Toxikologie und Bioproduktion eingesetzt. Sie eignen sich hervorragend für die Herstellung rekombinanter Proteine und die Entwicklung neuer Medikamente.

3.       Einsatz von Zelllinien in der Forschung

Die wichtigsten Untersuchungsbereiche für etablierte Zelllinien sind die Zellvermehrung, die Zellteilung, die Untersuchung des Arzneimittelstoffwechsels, die Genexpression, die Genfunktion, die Untersuchung biologischer Verbindungen und das allgemeine Verständnis biologischer Prozesse.

Zu den zahlreichen Anwendungen der Zelllinienforschung gehören die Herstellung von Impfstoffen, die Entwicklung von Medikamenten und die Entdeckung von Arzneimitteln, Untersuchungen an einzelnen Zellen, die Vermehrung von Viren und die Expression von Wirkstoffen durch die Herstellung rekombinanter Proteine und die Sekretion von natürlich sezernierten Proteinen in einer Zelllinie. Im Detail beschrieben sind die einzelnen Anwendungen untenstehend:

3.1.         Rekombinante Proteinproduktion in Säugetier- und Insektenzellen

Rekombinante Proteine werden hergestellt, indem zunächst das Gen, das für das gewünschte Protein kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert wird. Das Protein wird dann in Mikroorganismen wie Bakterien, Hefe oder tierischen Zellen in einer Laborumgebung produziert. Die menschlichen Gene, die für diesen Prozess verwendet werden, können nicht-kodierende DNA, so genannte Introns, enthalten, weshalb eine Version ohne Introns durch Umwandlung von mRNA in cDNA hergestellt wird. Die Expressionsvektoren stellen die erforderlichen Promotor-, Ribosomenbindungsstellen- und Terminatorsequenzen bereit. Die rekombinante Proteinproduktion wird in der Forschung häufig eingesetzt, da sie kostengünstig und effizient ist und eine angemessene Ausbeute bietet. Einige Proteine erfordern jedoch posttranslationale Modifikationen, die nur in eukaryotischen Zellen wie Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen stattfinden können. Diese Modifikationen können durch transiente Transfektion oder Produktion in Säugetierzellen erreicht werden, die in der Lage sind, qualitativ hochwertige Proteine zu produzieren, die den natürlichen ähnlich sind. E.coli wird aufgrund seiner gut verstandenen Genetik, seines schnellen Wachstums und seiner hohen Produktionsausbeute auch für die Herstellung zugelassener rekombinanter therapeutischer Proteine verwendet.

Aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine zu synthetisieren, sind eukaryotische Zelllinien für die Herstellung rekombinanter Proteine unverzichtbar geworden. Anderen Systemen fehlt die Fähigkeit, die Proteinfaltung und den Zusammenbau von Molekülen zu erleichtern. Die Herstellung rekombinanter Proteine beginnt mit der Entwicklung von Expressionsvektoren und der Transfektion in das Wirtssystem, gefolgt von Zellselektion, Klonierung, Screening und Evaluierung. Um die Qualitäts- und Skalierbarkeitsstandards zu erfüllen, benötigen die Hersteller rekombinanter Proteine effiziente und kostengünstige Expressionswirte.

3.2.         Herstellung von Viren

Die Einführung von Zellkulturtechniken hat die Isolierung und Vermehrung von Viren im Labor drastisch verändert. Zellbasierte Produktionsmethoden bieten einen praktischen und kostengünstigen Ansatz für die Isolierung, den Nachweis und die Identifizierung von Viren. Eine bessere Prozesskontrolle führt zu einem zuverlässigeren und besser charakterisierten Produkt mit schnelleren und kürzeren Produktionszyklen als bei Systemen auf Tier- oder Eibasis.

Zellbasierte Herstellungsverfahren sind für die Viruskultur- und Impfstoffproduktion von entscheidender Bedeutung für:

• Virusnachweis/-identifizierung
• Erforschung von Wirt-Pathogen-Interaktionen
• Struktur und Replikation von Viren Herstellung von Impfstoffen

3.3.         Bewertung der Toxizität

Bei der Bewertung der Toxizität neuer Medikamente, Chemikalien und Kosmetika wird die Verwendung von Tierzellkulturen als Alternative zu Tierversuchen immer beliebter. Die Niere und die Leber sind die wichtigsten Organe, die für die Herstellung und den Einsatz tierischer Zellkulturen in diesem Bereich verwendet werden.

3.4.         Zellbasierte Produktion

Tierische Zellkulturen haben das Potenzial, für die Massenproduktion von Viren genutzt zu werden, die dann in der Impfstoffherstellung verwendet werden können. Zahlreiche Impfungen, darunter die gegen Polio, Tollwut, Masern, Varizellen und Hepatitis B, haben von dieser Strategie profitiert.

Tierische Zellkulturen können nicht nur zur Herstellung von Viren, sondern auch zur Herstellung von gentechnisch veränderten Produkten mit kommerziellen und medizinischen Anwendungen verwendet werden. Es gibt zahlreiche Produktformen, wie z. B. monoklonale Antikörper, Insulin, Hormone usw.

3.5.         Screening und Entwicklung von Arzneimitteln

Assays auf der Grundlage von Tierzellkulturen werden zu einem immer wichtigeren Bestandteil der pharmazeutischen Industrie. Sie werden nicht nur für Toxizitätstests verwendet, sondern auch für das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Arzneimittel.

3.6.         Krebsstudien

Tierische Zellkulturen werden für die Biomarker- und Molekularforschung auf dem Gebiet der Krebserkrankungen eingesetzt. Darüber hinaus haben kultivierte Krebszellen das Potenzial, als Testmodelle für eine Vielzahl von Krebsmedikamenten zu dienen. Die jüngste Krebsforschung zielt darauf ab, Methoden zur selektiven Beseitigung von Krebszellen aus Populationen zu finden, die auch normale Primärzellen enthalten.

3.7.         Virologie

Gelegentlich werden tierische Zellkulturen für die Replikation von Viren verwendet, um Tierversuche zu umgehen. Diese replizierten Viren können für die Herstellung von Impfstoffen sowie für die Isolierung und Untersuchung grundlegender Viren verwendet werden.

3.8.         Genetische Modifikation

Das Wesen der Gentechnik besteht darin, die Gene eines Individuums so umzuschreiben, dass sie andere Proteine produzieren. Unter Transfektion versteht man die Fähigkeit, zusätzliches genetisches Material in Zellen einzubringen. Zu Zwecken der klinischen Forschung oder medizinischen Behandlung können tierische Zellkulturen einer Transfektion unterzogen werden, um eine beträchtliche Menge neuer Proteine zu erzeugen.

3.9.         Gen-Behandlung

Da wir jetzt wissen, dass tierische Zellkulturen für die Gentechnik verwendet werden können, wissen wir auch, dass genetisch veränderte Zellen für therapeutische Zwecke eingesetzt werden können. Die Zellen eines Patienten können entnommen und dann durch synthetische Zellen ersetzt werden, die das erforderliche funktionelle Gen enthalten. Diese Methode wird als Ex-vivo-Gentherapie bezeichnet. Alternativ kann das fehlende Gen auch mit Hilfe eines viralen Vektors in die Zellen des Patienten eingebracht werden.

3.10.      Behandlung mit Stammzellen

Sowohl in der Stammzellforschung als auch in der Stammzelltherapie werden Stammzellkulturen verwendet, die von tierischen Zellen stammen. In beiden Bereichen wurden vor allem mesenchymale und hämatopoetische Stammzellen verwendet. Tierische Zellkulturen, die aus somatischen Zellen verschiedener Tiere bestehen, wurden auch in der induzierten pluripotenten Stammzellenforschung eingesetzt. Tierische Zellkulturen haben das Potenzial, als Ersatz für Gewebe oder Organe zu dienen. Mit dieser Methode kann beispielsweise künstliche Haut hergestellt werden, die dann zur Behandlung von Menschen mit Verbrennungen oder Geschwüren eingesetzt werden kann. Andererseits kann die Forschung zur Züchtung künstlicher Organe wie Leber, Niere und Bauchspeicheldrüse.